宗毅，彭家艳，张琨，赵可惠，张传涛，龙坤兰，陈骏，周秀娟，高培阳▲，范刚
(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；
2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610075；
3.成都中医药大学 民族医药学院，四川 成都 611137)
2019年12月起，一种具有极强传染能力的新型冠状病毒(Corona Virus Disease 2019，COVID-19，简称“新冠肺炎”)在全球范围内迅速传播。2020-03-11世界卫生组织正式宣布将新冠肺炎列为全球性大流行病(Pandemic)[1]。截至2022年3月，全球因患新冠肺炎累计死亡人数已达六百万。最初冠状病毒的细胞感染被认为是通过与质膜直接融合进入细胞的，由病毒的表面突刺蛋白(Spike，S)介导发生，而后发现病毒的进入还可能涉及内吞作用。S蛋白由两个亚基组成：S1和S2，S1亚基允许病毒结合宿主细胞受体，而S2允许病毒和细胞膜融合[2]。在S蛋白与血管紧张素转换酶 2(ACE2)结合后，组织蛋白酶L(CTSL)切割S2位点，诱发膜融合[3]，经细胞内吞，病毒在SARS-CoV-2 3L水解酶(Mpro)的作用下进行RNA复制[4]，完成其分裂过程。
为充分发挥中医药在新冠肺炎预防、治疗、康复中的作用，结合时令特点和当前疫情防控形势，四川省中医药管理局组织专家对技术指南进行修订，形成了《四川省新型冠状病毒肺炎中医药防控技术指南(第六版)》。其中，成都中医药大学附属医院院内处方“新冠2号”由银花、连翘、厚朴等13味中药组成，具有辛凉解表、芳香化湿的功效，主要应用于治疗新冠肺炎引起的发热、不恶寒、咽干咽痛、胸闷、脘腹痞满等临床表现。
本文采用分子对接方法探究“新冠2号”处方干预新冠肺炎的机制。分子对接技术是一种能快速准确地预测蛋白-配体复合物结合构象和亲和力并辅助筛选活性成分的重要研究技术[5]，主要根据分子靶板的大型化合物库，采取基于结构或基于配体的方法，在可承受的时间内虚拟筛选数百万种化合物，从而预测小分子配体与合适的靶结合位点的结合构象[6]。这种先考虑先导化合物，进而设计药物[7]的方法也为增加药物的灵敏性、特殊性、预测性提供作用[8]。通过对“新冠2号”中的化合物与SARS-CoV-2 3L水解酶(Mpro)和组织蛋白酶L(CTSL，cathepsin L)两种靶蛋白进行对接，筛选其核心药物以及活性分子，以期进一步寻找抗新冠肺炎的中医药有效活性小分子，为中医药临床应用发展提供参考。
1.1 数据来源及软件
中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP：http://tcmspw.com/tcmsp.php)；
中医药百科全书数据库(ETCM：http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)；
网络药理在线数据库(TCMID：http://www.mega bionet.org/tcmid/)；
PubChem网站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；
RCSB PDB数库(https://www.rcsb.org/)；
Schr?dinger；
Maestro11.9、ChemBioDraw Ultra 14.0。
1.2 方法
1.2.1 “新冠2号”化学成分收集与处理
本研究通过《四川省新型冠状病毒肺炎中医药防控技术指南(第六版)》颁布的关于“新冠2号”全部中药成分为关键词在ETCM数据库、TCMSP数据库、TCMID数据库中检索，下载其(*.sdf)格式文件。此外以相关文献为辅助并使用ChemBioDraw Ultra 14.0软件画出小分子的结构，保存为(*.sdf)文件格式，进行整理归纳得到处方化学小分子结构数据库。
1.2.2 小分子配体和靶蛋白的获取与处理
将整理好的化合物SDF文件导入计算机辅助药物设计软件Schrödinger中，用默认的参数在LigPrep模块中的OPLS_2005力场下进行优化处理，获得小分子配体。并从PDB蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,简称PDB)中以(*.pdb)格式下载Mpro(PBD ID:6LU7)和CTSL(PBD ID:5MQY)的蛋白质结构。将两个靶标蛋白依次导入，对蛋白补缺失的侧链、调整键序、加氢、去水、去除无关溶剂等预处理步骤，并预测氨基酸的质子化状态(pH=7.0±2.0)，最后在OPLS_2005的力场下对蛋白质进行能量最小化，以确保蛋白具有合理的空间取向。
1.2.3 小分子配体与靶蛋白的分子对接
根据RCSB PDB中数据参考，选取Mpro、CTSL两种蛋白的已知自带的抑制剂小分子为中心，生成配体分子与受体分子的网格，相关参数设为默认值。在Ligand Docking模块导入处理好的靶蛋白以及“1.2.2”生成的小分子配体，在标准精度(SP)下进行柔性对接。并利用Glide gsore打分系统筛选最终结果。对于Glide Gscore SP一般认为其值≤-10时，小分子与蛋白的对接效果较好，其值≤-8时，小分子和蛋白质可能有不错的结合自由能。(https://www.schrodinger.com/kb/639)
2.1 “新冠2号”化学成分收集结果
由相关文献了解到，于明坤等通过对各地新型冠状病毒肺炎中医诊疗方案总结，新冠肺炎的认识病位在肺[9]，基本病机特点为“寒、湿、毒、疫”[10]。“新冠2号”制剂由银花、连翘、荆芥等13味药材组成，大多归肺、脾经，用于应对风热夹湿症，辛凉解表，芳香化湿，用于缓解发热、口渴、咽干咽痛、胸闷等临床表现症状。现针对处方中每味中药所含化学小分子数目、性味归经以及其功效应用进行归纳总结见表1。
表1 “新冠2号”中药化学成分数目、性味归经及其功效应用[11]
2.2 分子对接结果
“新冠2号”中的1 720个化学成分和2个新冠肺炎相关的靶蛋白进行分子对接，在SP精度下，共找到58个成分对接得分≤-8的小分子。以Mpro为对接蛋白，筛选得到对接得分≤-9的活性成分12个；
以CTSL为对接蛋白，筛选得到对接得分≤-9的1个活性成分，对接得分≤-8有9个活性成分，对接模式见图1，具体数据结果见表2。
图1 Mpro和CTSL与连翘酯苷F、厚朴苷B和1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-d-葡萄糖的分子对接模式
表2 小分子配体与Mpro、CTSL各靶蛋白的对接结果
“新冠2号”对接效果较好的小分子中有9个成分能同时作用于2个靶蛋白，包括1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-d-葡萄糖、连翘酯苷A、连翘酯苷F、连翘酯苷G、厚朴苷B、madreselvin B、1,3-二-[2-(3,4-二羟基苯基)-1-羧基]乙酯基(乙氧羰基)-2-(3,4-二羟基苯基)-7,8-二-羟基-1,2-二氢萘、1-[2-(3,4-二羟基苯基)-1-甲酯基(甲氧羰基)]乙酯基(乙氧羰基)-2-(3,4-二羟基苯基)-3-[2-(3,4-二羟基苯基)-1-羧基]乙酯基(乙氧羰基)-7,8-二羟基-1,2-二氢萘和半木脂素A均能同时作用于Mpro和CTSL。在与CTSL对接效果较好的9个活性小分子中，仅连翘酯苷B未与Mpro达到较好对接效果。
2.3 小分子配体与靶蛋白的结合模式分析
2.3.1 Mpro与其活性成分的结合模式分析
Mpro对于病毒的复制至关重要，是一个优秀的药物靶点。香磺苷和大豆脑苷与Mpro对接评分<-10，结合能力较为优异，二维对接结果如图2所示。小分子配体与Mpro的结合方式主要以氢键为主。以香磺苷为例，根据文献可知香磺苷作为金银花中活性化合物，参与金银花发挥抗菌、抗氧化、抗病毒等药理作用[13]。与作为氢键受体的ASN 142、GLU 166、THR 190氨基酸残基的羟基形成氢键，与氢键供体GLY 143氨基酸残基醚键中的氧形成氢键，对接评分为-10.632。
图2 Mpro(PBD ID:6LU7)与其活性成分的二维对接结果
2.3.2 CTSL与其活性成分的结合模式分析
组织蛋白酶L是一种肽酶，此前有报道称，CTSL参与了埃博拉和SARSCoV的病毒糖蛋白加工，这一病毒过程是细胞膜融合和宿主细胞进入的关键过程，CTSL对溶酶体中S蛋白启动病毒进入也非常重要[14]。从对接结果来看，madreselvin B、厚朴苷B、1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-d-葡萄糖、连翘酯苷A四个小分子对接评分较高，结合能力较为突出，二维对接结果如图3所示。小分子配体与CTSL的结合方式也主要以氢键为主。据相关研究指出，连翘具有显著的内毒素中和、解热以及清热解毒功效，有抑制多科致病菌(包括金黄色葡萄球菌)的作用[15-16]。以连翘酯苷A为例，是连翘主要特征性有效成分的一种苷类化合物，与作为氢键受体的ASN 66、GLN 21、GLY 20、MET 161氨基酸残基的羟基形成氢键，对接评分为-8.416。
图3 CTSL(PBD ID:5MQY)与其活性成分的二维对接结果
SARS-CoV-2进入靶细胞需要通过细胞蛋白酶启动S蛋白，S蛋白在S2位点上裂解。根据病毒株和细胞类型的不同，冠状病毒S蛋白可能被一个或多个宿主蛋白酶切割，其中就包括组织蛋白酶L。之后释放病毒RNA，在3Cl水解酶(Mpro)的作用下病毒开始复制[17]。本研究以Mpro和CTSL为靶蛋白，从“新冠2号”中筛选出多个成分能与之结合，符合中医药“多成分-多靶点”学说，为寻找Mpro、CTSL抑制剂分子提供参考。
对接结果表明，“新冠2号”中有13个小分子与CTSL、Mpro对接的效果较好，如连翘酯苷A、连翘酯苷B、香磺苷、厚朴苷B、1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-d-葡萄糖等，可能为与新冠病毒靶蛋白对接的活性成分。从药理作用角度分析，连翘作为一种广谱抗菌药，对多种革兰氏阳性及阴性细菌有抑制作用，有抑制病毒直接侵入人体的作用，而连翘酯苷类对金黄色葡萄球菌等十一种致病菌均有极强的抑制作用[18]；
金银花中香磺苷与两个靶蛋白均有潜在的结合能力，可能有抑制新冠病毒直接入侵人体细胞的作用；
1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-d-葡萄糖属于半夏多糖类，是一种天然的多酚化合物，其通过抑制许多细胞因子表现出抗炎作用[19]，并对脂多糖诱导的肺上皮细胞炎症损伤有一定的保护作用[20]，与两种靶蛋白结合均有较好的效果，有抑制冠状病毒复制和病毒与机体细胞结合的潜在能力。
综上所述，中药的方剂由活性成分群构成，活性成分群按照一定要求配伍组合，通过多靶点、多途径整合发挥作用[21]，这也是中药发挥效用的重要原因之一。利用中药多成分、多靶点的机制，与现代分子对接技术相结合，可以为中医药治疗新冠肺炎提供新的思路。本研究通过分子对接技术揭示了“新冠2号”治疗新型冠状病毒肺炎的潜在活性成分，研究结果可为“新冠2号”的临床应用和开发奠定基础，也可为寻找Mpro、CTSL抑制剂提供一定的参考。然而，分子对接为计算机虚拟筛选技术，发现的潜在活性成分今后还要进行进一步的药效验证。例如，可以采用制备液相色谱法从药材中分离得到这些潜在的活性成分，再结合啮齿类COVID-19动物模型[22]进行活性验证，从而确定药效物质。
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